Έκθεση αξιολόγησης του πρωτοκόλλου PCR-RT Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020

Η εξωτερική ομότιμη αναθεώρηση της δοκιμής RTPCR

για την ανίχνευση SARS-CoV-2  αποκαλύπτει 10 μεγάλες επιστημονικές ατέλειες σε μοριακό και μεθοδολογικό επίπεδο: συνέπειες για ψευδή θετικά αποτελέσματα.

Noέμβριος 27, 2020

Συγγραφείς

Pieter Borger⁽¹⁾, Bobby Rajesh Malhotra⁽²⁾ , Michael Yeadon⁽³⁾ , Clare Craig⁽⁴⁾, Kevin McKernan⁽⁵⁾ , Klaus Steger⁽⁶⁾ , Paul McSheehy⁽⁷⁾ , Lidiya Angelova⁽⁸⁾, Fabio Franchi⁽⁹⁾, Thomas Binder⁽¹⁰⁾, Henrik Ullrich⁽¹¹⁾ , Makoto Ohashi⁽¹²⁾, Stefano Scoglio⁽¹³⁾, Marjolein Doesburg-van Kleffens⁽¹⁴⁾, Dorothea Gilbert⁽¹⁵⁾, Rainer Klement⁽¹⁶⁾, Ruth Schruefer⁽¹⁷⁾, Berber W. Pieksma⁽¹⁸⁾, Jan Bonte⁽¹⁹⁾, Bruno H. Dalle Carbonare⁽²⁰⁾, Kevin P. Corbett⁽²¹⁾, Ulrike Kämmerer⁽²²⁾

Υπό το πρίσμα όλων των συνεπειών που προκύπτουν από αυτήν την ίδια δημοσίευση για τις κοινωνίες σε όλο τον κόσμο, μια ομάδα ανεξάρτητων ερευνητών πραγματοποίησε μια αναλυτική επισκόπηση της προαναφερθείσας δημοσίευσης στην οποία

1) όλα τα στοιχεία του σχεδιασμένου δοκιμαστικού σχεδιασμού ελέγχθηκαν διασταυρούμενα,

2) RT-qPCR πρωτόκολλο-συστάσεις αξιολογήθηκαν wrt ορθή εργαστηριακή πρακτική και

3) παράμετροι που εξετάστηκαν σε σχέση με τη σχετική επιστημονική βιβλιογραφία που καλύπτει τον τομέα.

Το δημοσιευμένο πρωτόκολλο RT-qPCR για την ανίχνευση και τη διάγνωση του 2019-nCoV και το χειρόγραφο υποφέρουν από πολλά τεχνικά και επιστημονικά σφάλματα, όπως ανεπαρκές σχεδιασμό εκκινητή, προβληματικό και ανεπαρκές πρωτόκολλο RT-qPCR και απουσία ακριβούς επικύρωσης δοκιμής.

Ούτε το τεστ που παρουσιάστηκε ούτε το ίδιο το χειρόγραφο πληρούν τις προϋποθέσεις για μια αποδεκτή επιστημονική έκδοση. Επιπλέον, δεν αναφέρονται σοβαρές συγκρούσεις συμφερόντων των συγγραφέων. Τέλος, το πολύ μικρό χρονικό διάστημα μεταξύ της υποβολής και της αποδοχής της δημοσίευσης (24 ώρες) σημαίνει ότι μια συστηματική διαδικασία αξιολόγησης από ομοτίμους είτε δεν πραγματοποιήθηκε εδώ είτε ήταν προβληματική και  κακής ποιότητας.

Παρέχουμε πειστικά αποδεικτικά στοιχεία για αρκετές επιστημονικές ανεπάρκειες, λάθη και ελαττώματα.

Εδώ. Η επιστολή αίτησης ανάκλησης του πρωτοκόλλου PCR-RT των επιστημόνων προς τη συντακτική επιτροπή της  Eurosurveillance 

Λαμβάνοντας υπόψη τις επιστημονικές και μεθοδολογικές βλάβες που παρουσιάζονται εδώ, είμαστε βέβαιοι ότι το συντακτικό συμβούλιο της Eurosurveillance δεν έχει άλλη επιλογή από το να ανακαλέσει τη δημοσίευση.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΦΑΛΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΒΡΕΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ

Το έγγραφο Corman-Drosten περιέχει τα ακόλουθα συγκεκριμένα σφάλματα:

1. Δεν υπάρχει συγκεκριμένος λόγος για τη χρήση αυτών των εξαιρετικά υψηλών συγκεντρώσεων εκκινητών σε αυτό το πρωτόκολλο. Οι περιγραφόμενες συγκεντρώσεις οδηγούν σε αυξημένες μη ειδικές συνδέσεις και ενισχύσεις προϊόντος PCR, καθιστώντας το τεστ ακατάλληλο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για την ταυτοποίηση του ιού SARS-CoV-2.

2. Έξι μη καθορισμένες ασταθείς θέσεις θα παρουσιάσουν μια τεράστια μεταβλητότητα στις πραγματικές εργαστηριακές υλοποιήσεις αυτού του τεστ,  η συγκεχυμένη μη ειδική περιγραφή στη δημοσίευση Corman-Drosten δεν είναι κατάλληλη ως Πρότυπο Πρωτόκολλο Λειτουργίας, καθιστώντας το τεστ ακατάλληλο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2.

3. Το τεστ δεν μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ ολόκληρου του ιού και των ιικών θραυσμάτων. Επομένως, το τεστ δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό για άθικτους (μολυσματικούς) ιούς, καθιστώντας το τεστ ακατάλληλο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2 και για να βγάλει συμπεράσματα σχετικά με την παρουσία λοίμωξης.

4. Διαφορά 10 ° C σε σχέση με τη θερμοκρασία ανόπτησης Tm για ζεύγος εκκινητών 1 (RdRp_SARSr_F και RdRp_SARSr_R) καθιστά επίσης τη δοκιμή ακατάλληλη ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για την αναγνώριση του ιού SARS-CoV-2.

5. Ένα σοβαρό σφάλμα είναι η παράλειψη μιας τιμής Ct στην οποία ένα δείγμα θεωρείται θετικό και αρνητικό. Αυτή η τιμή Ct δεν εντοπίζεται επίσης σε επακόλουθες υποβολές που καθιστούν τη δοκιμή ακατάλληλη ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για την αναγνώριση του ιού SARS-CoV-2.

6. Τα προϊόντα PCR δεν έχουν επικυρωθεί σε μοριακό επίπεδο. Αυτό το γεγονός καθιστά το πρωτόκολλο άχρηστο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2.

7. Η δοκιμή PCR δεν περιέχει ούτε έναν μοναδικό θετικό έλεγχο για την αξιολόγηση της ειδικότητάς του για το SARS-CoV-2 ούτε έναν αρνητικό έλεγχο για τον αποκλεισμό της παρουσίας άλλων κοροναϊών, καθιστώντας το τεστ ακατάλληλο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για την ταυτοποίηση του SARS-CoV-2 ιός.

8. Ο σχεδιασμός δοκιμών στη δημοσίευση Corman-Drosten είναι τόσο ασαφής και ελαττωματικός που μπορεί κανείς να ακολουθήσει διαφορετικές κατευθύνσεις, τίποτα δεν είναι τυποποιημένο και δεν υπάρχει SOP. Αυτό αμφισβητεί ιδιαίτερα την επιστημονική εγκυρότητα του τεστ και το καθιστά ακατάλληλο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2.

9. Πιθανότατα, η δημοσίευση Corman-Drosten δεν αξιολογήθηκε από ομοτίμους κάνοντας το τεστ ακατάλληλο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2.

10. Βρίσκουμε σοβαρές συγκρούσεις συμφερόντων για τουλάχιστον τέσσερις συγγραφείς, εκτός από το γεγονός ότι δύο από τους συγγραφείς της δημοσίευσης Corman-Drosten (Christian Drosten και Chantal Reusken) είναι μέλη του συντακτικού συμβουλίου της Eurosurveillance.

Προστέθηκε σύγκρουση συμφερόντων στις 29 Ιουλίου 2020 (ο Olfert Landt είναι διευθύνων σύμβουλος της TIB-Molbiol · ο Marco Kaiser είναι ανώτερος ερευνητής στο GenExpress και χρησιμεύει ως επιστημονικός σύμβουλος για την TIB-Molbiol), ο οποίος δεν δηλώθηκε στην αρχική έκδοση (και εξακολουθεί να είναι λείπει στην έκδοση PubMed) · Η TIB-Molbiol είναι η εταιρεία που ήταν η «πρώτη» που παρήγαγε κιτ PCR (Light Mix) με βάση το πρωτόκολλο που δημοσιεύθηκε στο χειρόγραφο Corman-Drosten και σύμφωνα με τις δικές τους λέξεις, διανέμειναν αυτά τα κιτ δοκιμής PCR πριν ακόμη να υποβληθεί η δημοσίευση [20] Επιπλέον, οι Victor Corman & Christian Drosten απέτυχαν να αναφέρουν τη δεύτερη τους σχέση: το εμπορικό εργαστήριο δοκιμών «Labor Berlin». Και οι δύο είναι υπεύθυνοι για τη διάγνωση ιών εκεί [21] και η εταιρεία δραστηριοποιείται στον τομέα των δοκιμών PCR σε πραγματικό χρόνο.

Υπό το φως της επανεξέτασης του πρωτοκόλλου δοκιμών για τον προσδιορισμό του SARS-CoV-2 που περιγράφεται στη δημοσίευση Corman-Drosten, έχουμε εντοπίσει σχετικά με σφάλματα και εγγενείς παραπλανητικές ενδείξεις που καθιστούν το τεστ SARS-CoV-2 PCR άχρηστο.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Η απόφαση σχετικά με το ποια πρωτόκολλα δοκιμής δημοσιεύονται και διατίθενται ευρέως βρίσκεται ακριβώς στα χέρια της Eurosurveillance. Μια απόφαση για την αναγνώριση των σφαλμάτων που φαίνονται στη δημοσίευση Corman-Drosten έχει το πλεονέκτημα να ελαχιστοποιήσει σημαντικά το ανθρώπινο κόστος και τα βάσανα.

Δεν είναι προς το συμφέρον της Eurosurveillance να αποσύρει αυτό το έγγραφο;

Το συμπέρασμά μας είναι σαφές. Ενόψει όλων των τεράστιων ατελειών και σφαλμάτων σχεδιασμού πρωτοκόλλου PCR που περιγράφονται εδώ, καταλήγουμε στο συμπέρασμα: Δεν υπάρχει μεγάλη επιλογή στο πλαίσιο της επιστημονικής ακεραιότητας και ευθύνης.

ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ 

Υπάρχουν δέκα κρίσιμα, μοιραία, προβλήματα με το έγγραφο Corman-Drosten που θα περιγράψουμε και θα εξηγήσουμε με μεγαλύτερη λεπτομέρεια στις ακόλουθες ενότητες.

Το πρώτο και σημαντικό ζήτημα είναι ότι ο νέος Coronavirus SARS-CoV-2, βασίζεται σε αλληλουχίες in silico (εκτελείται σε υπολογιστή ή μέσω προσομοίωσης υπολογιστή)  (θεωρητικές) , που παρέχεται από ένα εργαστήριο στην Κίνα [1], διότι εκείνη τη στιγμή δεν ήταν διαθέσιμο στους συγγραφείς ούτε υλικό ελέγχου μολυσματικού («ζωντανού») ή αδρανοποιημένου SARS-CoV-2 ούτε απομονωμένου γονιδιωματικού RNA του ιού. Μέχρι σήμερα δεν έχει πραγματοποιηθεί επικύρωση από τον συντάκτη με βάση απομονωμένους ιούς SARS-CoV-2 ή RNA πλήρους μήκους αυτών. Σύμφωνα με τους Corman et al .:

 

«Στόχος μας ήταν να αναπτύξουμε και να χρησιμοποιήσουμε μια ισχυρή διαγνωστική μεθοδολογία για χρήση σε εργαστήρια δημόσιας υγείας χωρίς να διαθέτουμε υλικό ιών».

Η εστίαση εδώ πρέπει να δοθεί στους δύο δηλωθέντες στόχους:

α) ανάπτυξη και β) χρησιμοποίηση του διαγνωστικού τεστ για χρήση σε εργαστήρια δημόσιας υγείας. Αυτοί οι στόχοι δεν είναι εφικτοί χωρίς να υπάρχει διαθέσιμο πραγματικό υλικό ιού (π.χ. για τον προσδιορισμό του μολυσματικού ιικού φορτίου). Σε κάθε περίπτωση, μόνο ένα πρωτόκολλο με μέγιστη ακρίβεια μπορεί να είναι ο υποχρεωτικός και πρωταρχικός στόχος σε οποιοδήποτε σενάριο-αποτέλεσμα αυτού του μεγέθους. Ο κρίσιμος προσδιορισμός του ιικού φορτίου είναι υποχρεωτικές πληροφορίες και είναι ευθύνη της ομάδας του Christian Drosten να πραγματοποιήσει αυτά τα πειράματα και να παράσχει τα κρίσιμα δεδομένα.

Παρ ‘όλα αυτά, αυτές οι θεωρητικές αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μεθοδολογίας δοκιμής RT-PCR για τον προσδιορισμό του προαναφερθέντος ιού. Αυτό το μοντέλο βασίστηκε στην υπόθεση ότι ο νέος ιός είναι πολύ παρόμοιος με το SARS-CoV από το 2003 καθώς ότι και οι δύο είναι βήτα-κορονοϊοί.

Η δοκιμή PCR λοιπόν σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας τη γονιδιωματική αλληλουχία του SARS-CoV ως υλικό ελέγχου για το συστατικό Sarbeco. το ξέρουμε αυτό από την προσωπική μας ηλεκτρονική επικοινωνία με [2] έναν από τους συν-συγγραφείς του Corman-Drosten. Αυτή η μέθοδος για το μοντέλο SARS-CoV-2 περιγράφηκε στη δημοσίευση Corman-Drosten ως εξής:

«Η καθιέρωση και επικύρωση μιας διαγνωστικής ροής εργασίας για τον έλεγχο 2019-nCoV και συγκεκριμένη επιβεβαίωση, σχεδιασμένη ελλείψει διαθέσιμων απομονωμένων ιών ή πρωτότυπων δειγμάτων ασθενών Ο σχεδιασμός και η επικύρωση ενεργοποιήθηκαν από τη στενή γενετική σχέση με το SARS-CoV του 2003 και υποβοηθήθηκε από τη χρήση της τεχνολογίας συνθετικών νουκλεϊκών οξέων. «

Η Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) είναι μια σημαντική βιομοριακή τεχνολογία για την ταχεία ανίχνευση σπάνιων RNA θραυσμάτων, τα οποία είναι γνωστά εκ των προτέρων. Στο πρώτο βήμα, τα μόρια RNA που υπάρχουν στο δείγμα μεταγράφονται αντίστροφα για απόδοση cDNA. Το cDNA στη συνέχεια ενισχύεται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος εκκινητών και ένα ένζυμο θερμοσταθερής DΝΑ πολυμεράσης. Η εξειδίκευση του PCR επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από σφάλματα βιομοριακού σχεδιασμού.

Τι είναι σημαντικό κατά το σχεδιασμό ενός τεστ RT-PCR και του ποσοτικού τεστ RT-qPCR που περιγράφεται στη δημοσίευση Corman-Drosten;

Οι συγγραφείς εισάγουν το ιστορικό του επιστημονικού τους έργου ως: »Το συνεχιζόμενο ξέσπασμα του πρόσφατα αναδυόμενου νέου κορονοιού (2019-nCoV) θέτει μια πρόκληση για τα εργαστήρια δημόσιας υγείας καθώς τα προϊόντα απομόνωσης ιών δεν είναι διαθέσιμα, ενώ υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η επιδημία είναι πιο διαδεδομένη από αρχικά σκέφτηκε, και η διεθνής εξάπλωση μέσω των ταξιδιωτών έχει ήδη συμβεί ».

Σύμφωνα με το BBC News [4] και το Google Statistics [5], υπήρχαν 6 θάνατοι παγκοσμίως στις 21 Ιανουαρίου 2020 – την ημέρα που υποβλήθηκε το χειρόγραφο. Γιατί οι συγγραφείς ανέλαβαν μια πρόκληση για τα εργαστήρια δημόσιας υγείας, ενώ εκείνη την εποχή δεν υπήρχαν ουσιαστικά στοιχεία που να δείχνουν ότι το ξέσπασμα ήταν πιο διαδεδομένο από ό, τι αρχικά πίστευε;

Oι πολύ υψηλές θερμοκρασίες των εκκινητών.Δεν υπάρχει συγκεκριμένος λόγος για τη χρήση αυτών των εξαιρετικά υψηλών συγκεντρώσεων εκκινητών σε αυτό το πρωτόκολλο. Αντίθετα, αυτές οι συγκεντρώσεις οδηγούν σε αυξημένη μη ειδική σύνδεση και ενίσχυση προϊόντος PCR.

Απροσδιόριστες («Wobbly») αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών

Οι παραλλαγές του σχεδιασμού θα οδηγήσουν αναπόφευκτα σε αποτελέσματα που δεν σχετίζονται κάν με το SARS CoV-2. Επομένως, η συγκεχυμένη μη ειδική περιγραφή στο χαρτί Corman-Drosten δεν είναι κατάλληλη ως τυπικό επιχειρησιακό πρωτόκολλο. Αυτές οι απροσδιόριστες θέσεις θα έπρεπε να είχαν σχεδιαστεί ξεκάθαρα.

Αυτές οι ταλαντευόμενες ακολουθίες έχουν ήδη δημιουργήσει μια πηγή ανησυχίας στον τομέα και οδήγησαν σε μια επιστολή προς τον συντάκτη που συνέταξε ο Pillonel et al. [8] σχετικά με τα κατάφωρα σφάλματα στις περιγραφόμενες ακολουθίες. Συμπλήρωση. Αυτά τα σφάλματα είναι αυτονόητα στους Corman et al. επίσης.

Το πρωτόκολλο WHO (Σχήμα 1), το οποίο προέρχεται άμεσα από το χαρτί Corman-Drosten, καταλήγει στο συμπέρασμα ότι για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του SARS-CoV-2, πρέπει να προσδιοριστούν δύο γονίδια ελέγχου (τα γονίδια E-και RdRp) στην ανάλυση.

Το έγγραφο Corman-Drosten προσδιορίζει περαιτέρω ένα τρίτο γονίδιο το οποίο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της ΠΟΥ, δεν επικυρώθηκε περαιτέρω και θεωρήθηκε περιττό:

Αξίζει να σημειωθεί ότι η ανάλυση γονιδίου Ν είχε επίσης καλή απόδοση, αλλά δεν υποβλήθηκε σε εντατική περαιτέρω επικύρωση επειδή ήταν ελαφρώς λιγότερο ευαίσθητη. «

Αυτή ήταν μια ατυχής παράλειψη, καθώς θα ήταν καλύτερο να χρησιμοποιηθούν και τα 3 γονίδια PCR ως επιβεβαιωτικοί προσδιορισμοί, και αυτό θα είχε ως αποτέλεσμα ένα σχεδόν επαρκές πρωτόκολλο διάγνωσης εργαλείων ανίχνευσης RNA ιού. Τρία επιβεβαιωτικά βήματα ανάλυσης θα ελαχιστοποιούσαν τουλάχιστον τα σφάλματα και τις αβεβαιότητες σε κάθε φάση αναφορικά με τα σημεία «Wobbly». (Παρ ‘όλα αυτά, το πρωτόκολλο θα εξακολουθούσε να στερείται οποιασδήποτε «καλής εργαστηριακής πρακτικής», όταν συνυπολογίζει όλα τα άλλα σφάλματα σχεδιασμού).

Ως έχει, ο προσδιορισμός γονιδίου Ν δεν προτείνεται δυστυχώς ούτε στη σύσταση του ΠΟΥ (Σχήμα 1) ως υποχρεωτικό και κρίσιμο τρίτο επιβεβαιωτικό βήμα, ούτε τονίζεται στο έγγραφο Corman-Drosten ως σημαντική προαιρετική διαβεβαίωση «για μια ροή εργασιών ρουτίνας» (Πίνακας 2).

Κατά συνέπεια, σε όλες σχεδόν τις διαδικασίες δοκιμών σε όλο τον κόσμο, χρησιμοποιήθηκαν μόνο 2 εκκινητών αντί για τους τρεις. Αυτή η επίβλεψη καθιστά ολόκληρο το πρωτόκολλο δοκιμών άχρηστο όσον αφορά την παροχή ακριβών αποτελεσμάτων δοκιμής πραγματικής σημασίας σε μια συνεχιζόμενη πανδημία.

Σχήμα 1: Η επιβεβαιωτική δοκιμασία N-Gene δεν τονίζεται ως απαραίτητο τρίτο βήμα στην επίσημη σύσταση του πρωτοκόλλου WHO Drosten-Corman παρακάτω [8] ούτε απαιτείται ως κρίσιμο βήμα για υψηλότερη ακρίβεια δοκιμών στη δημοσίευση Eurosurveillance.

Το RT-PCR δεν συνιστάται για πρωτογενή διάγνωση λοίμωξης. Γι ‘αυτό το τεστ RT-PCR που χρησιμοποιείται στην κλινική ρουτίνα για την ανίχνευση του COVID-19 δεν ενδείκνυται για διάγνωση COVID-19 σε κανονική βάση.

«Οι γιατροί πρέπει να αναγνωρίσουν την βελτιωμένη ακρίβεια και ταχύτητα των μοριακών διαγνωστικών τεχνικών για τη διάγνωση λοιμώξεων, αλλά και να κατανοήσουν τους περιορισμούς τους. Τα εργαστηριακά αποτελέσματα πρέπει πάντα να ερμηνεύονται στο πλαίσιο της κλινικής παρουσίασης του ασθενούς και απαιτείται κατάλληλη τοποθεσία, ποιότητα και χρόνος συλλογής δειγμάτων για αξιόπιστα αποτελέσματα των δοκιμών ». [9]

Ωστόσο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να βοηθήσει τη διαφορική διάγνωση του γιατρού όταν πρέπει να κάνει διάκριση μεταξύ διαφορετικών λοιμώξεων του πνεύμονα (η γρίπη, η Covid-19 και το SARS έχουν πολύ παρόμοια συμπτώματα). Για επιβεβαιωτική διάγνωση ενός συγκεκριμένου ιού, πρέπει να εφαρμόζονται τουλάχιστον 3 ειδικά ζεύγη εκκινητών για την ανίχνευση 3 ειδικών για τον ιό γονιδίων. Κατά προτίμηση, αυτά τα γονίδια-στόχοι πρέπει να εντοπίζονται με τη μεγαλύτερη δυνατή απόσταση στο ιικό γονιδίωμα (περιλαμβάνοντας τα αντίθετα άκρα).

Αν και το έγγραφο Corman-Drosten περιγράφει 3 εκκινητές, αυτοί οι εκκινητές καλύπτουν μόνο περίπου το μισό του γονιδιώματος του ιού. Αυτός είναι ένας άλλος παράγοντας που μειώνει την ειδικότητα για την ανίχνευση ανέπαφου RNA ιού COVID-19 και αυξάνει την αναφορά ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων δοκιμών.

Επομένως, ακόμη και αν λάβουμε τρία θετικά σήματα (δηλαδή τα τρία ζεύγη εκκινητών δίνουν 3 διαφορετικά προϊόντα ενίσχυσης) σε ένα δείγμα, αυτό δεν αποδεικνύει την παρουσία ενός ιού.

Ένας καλύτερος σχεδιασμός εκκινητή θα είχε τερματικούς εκκινητές και στα δύο άκρα του ιικού γονιδιώματος. Αυτό συμβαίνει επειδή ολόκληρο το ιικό γονιδίωμα θα καλυφθεί και τρία θετικά σήματα μπορούν καλύτερα να κάνουν διάκριση μεταξύ ενός πλήρους (και επομένως δυνητικά μολυσματικού) ιού και κατακερματισμένων ιογενών γονιδιωμάτων (χωρίς μολυσματική ισχύ).

Προκειμένου να συναχθεί κάτι σημαντικό για τη μολυσματικότητα του ιού, το γονίδιο Orf1, το οποίο κωδικοποιεί το βασικό ένζυμο ρεπλικάσης των ιών SARS-CoV, θα έπρεπε να είχε συμπεριληφθεί ως στόχος (Σχήμα 2). Η τοποθέτηση των στόχων στην περιοχή του ιικού γονιδιώματος που μεταγράφεται περισσότερο και μεταβλητά είναι μια άλλη αδυναμία του πρωτοκόλλου.

Αυτά είναι σοβαρά σφάλματα σχεδιασμού, καθώς η δοκιμή δεν μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ ολόκληρου του ιού και των ιογενών θραυσμάτων. Το τεστ δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό για ιούς SARS.

Σχήμα 2: Σχετικές θέσεις των στόχων του αμπλικονίου στον SARS coronavirus και το νέο γονιδίωμα coronavirus του 2019. ORF: ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης. RdRp: RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση. Οι αριθμοί κάτω από το αμπλικόνιο είναι θέσεις γονιδιώματος σύμφωνα με το SARS-CoV, NC_004718 [1].

Σχήμα 3: Μια δοκιμή με το εργαλείο web dimer primer Thermofischer αποκαλύπτει ότι ο εμπρὀσθιος εκκινητής RdRp έχει ομολογία 6bp 3 «με το Sarbeco E Reverse (αριστερό πλαίσιο). Μια άλλη δοκιμή αποκαλύπτει ότι υπάρχει ένας τέλειος συνδυασμός για έναν από τους Ν-εκκινητές με ένα κλινικό παθογόνο (Pantoea) που βρίσκεται σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς (δεξί κουτί).

Τα σφάλματα σχεδιασμού που περιγράφονται εδώ είναι τόσο σοβαρά που είναι πολύ απίθανο να συμβεί συγκεκριμένη ενίσχυση του γενετικού υλικού SARS-CoV-2 χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του χαρτιού Corman-Drosten.

3. Ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης
   Πρέπει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει καμία αναφορά στο χαρτί Corman-Drosten ότι μια δοκιμή είναι θετική ή αρνητική, ή πράγματι αυτό που ορίζει ένα θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα. Αυτοί οι τύποι ιολογικών διαγνωστικών δοκιμών πρέπει να βασίζονται σε SOP, συμπεριλαμβανομένου ενός επικυρωμένου και σταθερού αριθμού κύκλων PCR (τιμή Ct) μετά τους οποίους ένα δείγμα θεωρείται θετικό ή αρνητικό. Η μέγιστη λογικά αξιόπιστη τιμή Ct είναι 30 κύκλοι. Πάνω από ένα Ct των 35 κύκλων, πρέπει να αναμένεται ταχέως αυξανόμενος αριθμός ψευδών θετικών.

Τα δεδομένα PCR που αξιολογούνται ως θετικά μετά από τιμή Ct 35 κύκλων είναι εντελώς αναξιόπιστα.

Παραθέτοντας τους Jaafar et al. 2020 [3]: «Στο Ct = 35, η τιμή που χρησιμοποιήσαμε για να αναφέρουμε ένα θετικό αποτέλεσμα για PCR, <3% των καλλιεργειών είναι θετικές.» Με άλλα λόγια, δεν υπήρξε επιτυχής απομόνωση του ιού του SARS-CoV-2 σε αυτές τις υψηλές τιμές Ct.

Περαιτέρω, επιστημονικές μελέτες δείχνουν ότι μόνο μη μολυσματικοί (νεκροί) ιοί ανιχνεύονται με τιμές Ct 35 [22].

Μεταξύ 30 και 35 υπάρχει μια γκρίζα περιοχή, όπου ένα θετικό τεστ δεν μπορεί να αποδειχθεί με βεβαιότητα. Αυτή η περιοχή πρέπει να αποκλειστεί. Φυσικά, μπορεί κανείς να εκτελέσει 45 κύκλους PCR, όπως συνιστάται στο πρωτόκολλο Corman-Drosten WHO (Σχήμα 4), αλλά τότε πρέπει επίσης να ορίσετε μια λογική τιμή Ct (η οποία δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 30). Αλλά ένα αναλυτικό αποτέλεσμα με τιμή Ct 45 είναι επιστημονικά και διαγνωστικά απολύτως χωρίς νόημα (μια λογική τιμή Ct δεν πρέπει να υπερβαίνει το 30).

Όλα αυτά πρέπει να κοινοποιούνται πολύ καθαρά. Είναι σημαντικό λάθος το ότι η δημοσίευση Corman-Drosten δεν αναφέρει τη μέγιστη τιμή Ct στην οποία ένα δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αναμφίβολα ως θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα δοκιμής. Αυτό το σημαντικό όριο κύκλου κατωφλίου επίσης δεν καθορίζεται σε καμία υποβολή μέχρι σήμερα.

Σχήμα 4: Σύσταση κιτ RT-PCR στο επίσημο πρωτόκολλο Corman-Drosten WHO [8]. Μόνο μια τιμή «Cycler» (κύκλοι) μπορεί να βρεθεί χωρίς αντίστοιχη και επιστημονικά λογική Ct (Cutoff-value). Αυτή ή οποιαδήποτε άλλη τιμή κύκλου δεν υπάρχει πουθενά στο πραγματικό χαρτί Corman-Drosten.

Το γεγονός ότι αυτά τα προϊόντα PCR δεν έχουν επικυρωθεί σε μοριακό επίπεδο είναι ένα άλλο εντυπωσιακό σφάλμα του πρωτοκόλλου, καθιστώντας κάθε δοκιμή που βασίζεται σε αυτό άχρηστο ως ειδικό διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2.

5. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι για επιβεβαίωση / αμφισβήτηση συγκεκριμένης ανίχνευσης ιών.
   Η μη επιβεβαιωμένη υπόθεση που περιγράφεται στο έγγραφο Corman-Drosten είναι ότι ο SARS-CoV-2 είναι ο μόνος ιός από την ομάδα β-κορονοϊού που μοιάζει με SARS και προκαλεί λοιμώξεις σε ανθρώπους. Οι αλληλουχίες στις οποίες βασίζεται η μέθοδος PCR είναι σε αλληλουχίες θεωρητικές , που παρέχονται από εργαστήριο στην Κίνα [23], επειδή κατά τη στιγμή της ανάπτυξης της δοκιμής PCR δεν υπήρχε υλικό ελέγχου μολυσματικού («ζωντανού») ή αδρανοποιημένου SARS-CoV- 2 διαθέσιμο στους συγγραφείς. Η δοκιμή PCR λοιπόν σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας την ακολουθία του γνωστού SARS-CoV ως υλικού ελέγχου για το συστατικό Sarbeco (Dr. Meijer, συν-συγγραφέας Corman-Drosten σε ανταλλαγή email με τον Δρ. Peter Borger) [2].

Όλα τα άτομα που εξετάζονται θετικά με τη δοκιμή RT-PCR, όπως περιγράφεται η δημοσίευση Corman-Drosten, θεωρούνται θετικά για μολύνσεις SARS-CoV-2.

Υπάρχουν τρία σοβαρά ελαττώματα στην υπόθεσή τους.

Πρώτον, μια θετική δοκιμασία για τα μόρια RNA που περιγράφονται στη δημοσίευση Corman-Drosten δεν μπορεί να εξομοιωθεί με «μόλυνση από ιό». Ένα θετικό τεστ RT-PCR δείχνει απλώς την παρουσία μορίων RNA ιού. Όπως αποδεικνύεται στο σημείο 1δ (παραπάνω), η δοκιμή Corman-Drosten δεν σχεδιάστηκε για την ανίχνευση του ιού πλήρους μήκους, αλλά μόνο ένα τμήμα του ιού.

Καταλήξαμε ήδη στο συμπέρασμα ότι αυτό κατατάσσει το τεστ ως ακατάλληλο ως διαγνωστικό τεστ για λοιμώξεις από ιούς SARS.

Δεύτερον και μείζονος σημασίας, η λειτουργικότητα του δημοσιευμένου τεστ RT-PCR δεν αποδείχθηκε με τη χρήση ενός θετικού μάρτυρα (απομονωμένο SARS-CoV-2 RNA) που είναι ένα βασικό επιστημονικό Gold standard.

Τρίτον, το έγγραφο Corman-Drosten αναφέρει:

«Για να δείξουμε ότι οι προσδιορισμοί μπορούν να ανιχνεύσουν άλλους ιούς που σχετίζονται με το SARS που σχετίζονται με τις νυχτερίδες, χρησιμοποιήσαμε τον προσδιορισμό γονιδίου Ε για να δοκιμάσουμε έξι δείγματα κοπράνων που προέρχονται από νυχτερίδες διαθέσιμα από τους Drexler et al. […] Und Muth et al. […]. Αυτά τα θετικά στον ιό δείγματα προέρχονταν από ευρωπαϊκές νυχτερίδες. Η ανίχνευση αυτών των φυλογενετικών ακραίων συνθηκών στο σχετικό SARS Cov κλάδο υποδηλώνει ότι όλοι οι ασιατικοί ιοί είναι πιθανό να εντοπιστούν. Αυτό, θεωρητικά, θα εξασφάλιζε ευρεία ευαισθησία ακόμη και σε περίπτωση πολλαπλών ανεξάρτητων αποκτήσεων παραλλαγών ιών από μια δεξαμενή ζώων. «

Αυτή η δήλωση αποδεικνύει ότι το γονίδιο Ε που χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμή RT-PCR, όπως περιγράφεται στη δημοσίευση Corman-Drosten, δεν είναι ειδικό για το SARS-CoV-2.

Η δοκιμή PCR στη δημοσίευση Corman-Drosten δεν περιέχει επομένως ούτε ένα μοναδικό θετικό μάρτυρα ούτε αρνητικό έλεγχο για να αποκλείσει την παρουσία άλλων κοροναϊών. Αυτό είναι ένα άλλο μεγάλο ελάττωμα σχεδιασμού που χαρακτηρίζει το τεστ ως ακατάλληλο για διάγνωση.

Η δοκιμή RT-PCR που περιγράφεται στη δημοσίευση Corman-Drosten περιέχει τόσα πολλά μοριακά σφάλματα βιολογικού σχεδιασμού (βλ. 1-5) που δεν είναι δυνατόν να επιτευχθούν σαφή αποτελέσματα. Είναι αναπόφευκτο αυτό το τεστ να δημιουργήσει έναν τεράστιο αριθμό από τα λεγόμενα «ψευδώς θετικά». Ο ορισμός των ψευδών θετικών είναι ένα αρνητικό δείγμα, το οποίο αρχικά βαθμολογείται θετικό, αλλά το οποίο είναι αρνητικό μετά την επανεξέταση με το ίδιο τεστ. Τα ψευδώς θετικά είναι λανθασμένα θετικά αποτελέσματα δοκιμών, δηλαδή αρνητικά δείγματα που είναι θετικά. Και αυτό είναι πράγματι αυτό που υπάρχει στο έγγραφο Corman-Drosten. Στη σελίδα 6 του χειρόγραφου PDF οι συγγραφείς αποδεικνύουν ότι ακόμη και υπό καλά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες, δημιουργείται ένα σημαντικό ποσοστό ψευδών θετικών με αυτήν τη δοκιμή:

Σε τέσσερις μεμονωμένες αντιδράσεις δοκιμής, παρατηρήθηκε ασθενής αρχική αντιδραστικότητα, ωστόσο ήταν αρνητικές κατά την επανεξέταση με την ίδια δοκιμασία.

8.Το έγγραφο Corman-Drosten δεν αξιολογήθηκε από ομοτίμους

Πριν από την επίσημη δημοσίευση σε ένα επιστημονικό περιοδικό, επιστημονικά και ιατρικά άρθρα είναι παραδοσιακά πιστοποιημένα από «peer review». Σε αυτήν τη διαδικασία, οι συντάκτες του περιοδικού λαμβάνουν συμβουλές από διάφορους εμπειρογνώμονες («διαιτητές») που έχουν αξιολογήσει το έγγραφο και ενδέχεται να εντοπίσουν αδυναμίες στις παραδοχές, τις μεθόδους και τα συμπεράσματά του. Συνήθως ένα περιοδικό θα δημοσιεύει ένα άρθρο μόνο όταν οι συντάκτες είναι ικανοποιημένοι ότι οι συγγραφείς έχουν εξετάσει τις ανησυχίες των διαιτητών και ότι τα δεδομένα που παρουσιάζονται υποστηρίζουν τα συμπεράσματα που συντάσσονται στο έγγραφο. « Αυτή η διαδικασία περιγράφεται επίσης καλά για την Eurosurveillance [16].

Το έγγραφο Corman-Drosten υποβλήθηκε στην Eurosurveillance στις 21 Ιανουαρίου 2020 και έγινε δεκτό για δημοσίευση στις 22 Ιανουαρίου 2020. Στις 23 Ιανουαρίου 2020 το έγγραφο ήταν online

Στις 13 Ιανουαρίου 2020, η έκδοση 1-0 του πρωτοκόλλου δημοσιεύθηκε στον επίσημο ιστότοπο του ΠΟΥ [17], ενημερώθηκε στις 17 Ιανουαρίου 2020 ως έκδοση εγγράφου 2-1 [18], ακόμη και πριν από την έκδοση του εγγράφου Corman-Drosten στις 23 Ιανουαρίου στις Ευρω-επιτήρηση.

Κανονικά, η αξιολόγηση από ομοτίμους είναι μια χρονοβόρα διαδικασία, καθώς τουλάχιστον δύο εμπειρογνώμονες από τον τομέα πρέπει να διαβάσουν και να σχολιάσουν κριτικά την υποβληθείσα εργασία. Κατά τη γνώμη μας, αυτό το έγγραφο δεν αξιολογήθηκε από ομοτίμους. Είκοσι τέσσερις ώρες απλά δεν αρκούν για να πραγματοποιήσουν μια εμπεριστατωμένη αξιολόγηση από ομοτίμους. Το συμπέρασμά μας υποστηρίζεται από το γεγονός ότι εντοπίστηκε τεράστιος αριθμός πολύ σοβαρών ελαττωμάτων σχεδιασμού από εμάς, οι οποίες κάνουν τη δοκιμή PCR εντελώς ακατάλληλη ως διαγνωστικό εργαλείο για τον εντοπισμό του ιού SARS-CoV-2. Οποιοσδήποτε μοριακός βιολόγος εξοικειωμένος με το σχεδιασμό RT-PCR θα είχε παρατηρήσει εύκολα τα σοβαρά σφάλματα που υπάρχουν στο έγγραφο Corman-Drosten πριν από την πραγματική διαδικασία αναθεώρησης.

Ζητήσαμε από την Eurosurveillance στις 26 Οκτωβρίου 2020 να μας στείλει ένα αντίγραφο της έκθεσης αξιολόγησης από ομοτίμους. Μέχρι σήμερα, δεν έχουμε λάβει αυτήν την έκθεση και σε επιστολή της 18ης Νοεμβρίου 2020, το ECDC ως οικοδεσπότης της Eurosurveillance αρνήθηκε να παράσχει πρόσβαση χωρίς να παράσχει ουσιαστικούς επιστημονικούς λόγους για την απόφασή τους. Αντιθέτως, γράφουν ότι «η αποκάλυψη θα υπονόμευε τον σκοπό των επιστημονικών ερευνών». [24].

Συγγραφείς ως συντάκτες

Ένα τελευταίο σημείο είναι ένα από τα κύρια προβλήματα. Αποδεικνύεται ότι δύο συγγραφείς της δημοσίευσης Corman-Drosten, Christian Drosten και Chantal Reusken, είναι επίσης μέλη του συντακτικού συμβουλίου αυτού του περιοδικού [19].

Ως εκ τούτου, υπάρχει μια σοβαρή σύγκρουση συμφερόντων που ενισχύει τις υποψίες ότι το έγγραφο δεν αξιολογήθηκε από ομοτίμους. Έχει την εμφάνιση ότι η ταχεία δημοσίευση ήταν δυνατή απλώς και μόνο επειδή οι συγγραφείς ήταν επίσης μέρος του συντακτικού συμβουλίου της Eurosurveillance. Αυτή η πρακτική χαρακτηρίζεται ως συμβιβαστική επιστημονική ακεραιότητα.

ΠΗΓΗ

External peer review of the RTPCR test to detect SARS-CoV-2 reveals 10 major scientific flaws at the molecular and methodological level: consequences for false positive results.